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      基因編輯到底會不會脫靶?中國科學家用最新研究給出了解答

      鬼谷藏龍 發表于  2019-03-01 15:36

      |·?本文來自“我是科學家”·|

      自從以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術被發明以來,有一個詞就像幽靈般盤旋在這個領域中,那就是“脫靶”。人人都討論它,人人都害怕它,但卻沒人看得到它。

      圖片來源:Pixabay

      然而在昨天,這個幽靈終于被人抓住了,中科院神經所楊輝實驗室團隊與合作者開發了一套名為GOTI的新技術,讓基因編輯的脫靶從此無所遁形,相關論文發表在3月1日的《科學》(Science)上[1]

      GOTI新技術讓基因編輯的脫靶從此無所遁形。

      一槍打在了別人的靶子上

      在2004年雅典奧運會男子50米步槍三姿決賽中,美國選手埃蒙斯遙遙領先,到了要打最后一槍的時候,他已然遙遙領先第二名整整三環。勝卷在握的他屏息凝神開了這一槍,又一次把子彈準確送到了差不多是靶心的位置,然而他的記分牌上卻顯示出一個匪夷所思的成績:

      脫靶。

      原來埃蒙斯犯了一個莫名其妙的錯誤——他最后一槍打在了別人的靶子上。

      埃蒙斯:我怎么會……圖片來源:GETTY IMAGES

      奧運會的頂尖選手如此,生命科學的頂尖技術亦是如此。

      近年來很火的技術“基因編輯”,就有這個問題。盡管以CRISPR/Cas9等為代表的新一代基因編輯以精確著稱,但它們時不時就是會犯這種“打到別人靶子上”的毛病——我們本來要讓它去編輯A基因,但它卻意外搞壞了B基因。

      基因編輯的脫靶和奧運選手的脫靶一樣都是極小概率的事件,但常在河邊走哪能不見鬼,每一次基因編輯操作,本質上都是成千上萬的基因編輯工具對著成千上萬的細胞做了成千上萬次編輯,焉能保證次次不失手呢?

      圖片來源:圖蟲創意

      奧運選手脫靶最多丟塊金牌,基因編輯脫靶了,丟的沒準就是性命了。然而基因編輯技術宛如一輛勢不可擋的戰車,正以雷霆萬鈞之勢向著臨床領域疾馳而來。

      然而這歷史的車輪真的不能擋嗎?又該不該擋一下呢?

      查明脫靶率可沒那么容易

      還是拿奧運會打個比方吧,雖然奧運選手脫靶是個小概率事件,但是只要觀察的次數足夠多,就能夠統計出他平均中靶多少次會出現一次脫靶,這個就是就叫做“脫靶率”。

      知道了脫靶率,我們才能制定一個標準。比如說規定平均一萬槍內不能出現超過一次脫靶,張三脫靶率是千分之一,那他就不合格;李四脫靶率千萬分之一,那他就值得信賴。

      然而頗顯尷尬的是,這么多年來,無論是支持基因編輯脫靶還是反對基因編輯脫靶,大家很大程度都只憑著一種“信仰”,卻從來沒有人真正弄清過基因編輯的脫靶率到底是多少。

      這是因為,基因編輯的脫靶率真的太難檢測了。

      射擊運動員的脫靶率可以直接“數”出來,基因編輯的脫靶率該怎樣計算呢?也許有人會說,這很簡單呀,把一批樣本分成兩組,一組做基因編輯,一組不做,然后比對一下兩組的基因差異不就成了么?

      2017年, Bassuk等幾位科學家還真就這么干了[2],他們用CRISPR/Cas9技術編輯了幾枚小鼠的受精卵,等這些受精卵發育成小鼠出生后檢測了它們的基因,并將其與同一品系的其它小鼠作對比,結果居然發現了“一千多處難以預料的基因突變”。

      盡管這個結果立馬成了各大媒體的頭條,但它卻受到了學術圈內一致的口誅筆伐,因為這個檢測犯了一個很低級的錯誤:世界上沒有兩只基因完全一樣的小鼠。Bassuk的實驗無法區分比對出來的基因差異究竟來自于基因編輯,還是小鼠之間本來就有的個體差異。

      在一片指責聲中,來自中科院神經科學研究所楊輝實驗室的博士后左二偉(還記得嗎?就是那個敲染色體的 CRISPR又有新用場了!這或許是唐氏綜合征患者的福音 )卻萌生了一個清奇的想法,當時他一拍大腿說,艾瑪好機會啊,只要立刻用非常嚴謹的科學方法重做一下論文的工作,然后得出否定的結論反駁它,不就白撿一篇Nature methods嘛。

      做著做著,他就發現,這個“非常嚴謹的科學方法”其實并不簡單(不然早幾年全世界的科學家不就早該做了么)。更慘的是,他的工作鋪開沒過多久,Bassuk的論文就被撤稿了(詳情請見:震驚!國際頂尖期刊宣布CRISPR有毒!震驚again!它又撤稿了!)。

      不過,左二偉博士還是決定研究下這個問題,世界上不是有一句魔咒叫做“來都來了”嘛,順便做做看吧……

      一念之間的歷史的走向

      經過與導師的討論,一個可以精準檢測脫靶的方案還真的慢慢成型了。然而正是在左二偉博士“順便”研究脫靶問題的這段時間里,基因編輯臨床化的腳步卻在日益加快。

      2018年1月,美國批準了賓州大學一項利用CRISPR/Cas9修復免疫缺陷的臨床試驗。

      2018年8月,歐洲多個國家批準了張鋒的CRISPR Therapeutics公司的用CRISPR/Cas9治療β地中海貧血癥的臨床試驗。

      2018年11月,解放軍總醫院的基于基因編輯T細胞治療癌癥的臨床試驗申請也被通過。

      更遑論2018年11月份,原南方科技大學副教授賀建奎公然宣布自己做出了人類首例基因編輯嬰兒。細思極恐的是,賀建奎之后,居然還有不少力挺他的聲音,其中不乏國際最頂尖的科學家。

      張鋒和David Liu等等也是極大地加快了基因編輯臨床化的速度。

      張鋒在他的實驗室中。 圖片來源:sciencenews.org

      畢竟,誰第一個取得了臨床化基因編輯的突破,誰就率先霸占了一塊醫療的制高點,這其中的利益真的太誘人了。乃至一時之間萬馬奔騰,有些人似乎已經不在乎這其實還是一項風險未知的技術了。

      突然之間,左二偉博士乃至整個楊輝實驗室都好像無意中站在了歷史的節點上,這個隨手做做的課題突然將會變得足以決定這個領域的歷史走向——

      檢測出來如果證明基因編輯不易脫靶當然皆大歡喜,但如果證明它容易脫靶呢?且不說楊輝自己實驗室里那些涉及基因編輯向臨床轉化的課題將面臨考驗,還可能由此在行業內掀起一場地震。

      最終,左二偉博士在與導師楊輝研究員以及所長蒲慕明等人商議后,大家還是決定繼續做下去,畢竟……

      得有人站出來承擔這個責任呀。

      檢測脫靶,阻礙重重

      阻礙檢測脫靶率的,除了“個體差異”外,還有另一個障礙。

      什么障礙呢?我們繼續用射擊做比方:能得分的目標靶子通常是唯一的,而目標外的“別人家的靶子”可就是千千萬萬各有不同了。想象一下,如果隨便撒一把CRISPR/Cas9去編輯十萬個細胞的基因,假設每個都脫靶,且這些脫靶都是隨機產生的,那么這十萬個細胞最多就會有十萬種脫靶,每一種脫靶形式只占了所有樣本的十萬分之一,這種微乎其微的異常幾乎不可能被檢測出來。

      因此,脫靶檢測需要依賴所謂的“單細胞測序”,通俗來說,就是實驗組和對照組都只有一個細胞。這樣的對比當然就能很容易發現差別,但是很顯然,一個細胞那一丁點DNA是根本不夠拿來檢測的。為了解決這個矛盾,就要用到“體外擴增”技術,把那一丁點DNA樣本復制成千上萬份,直到數量滿足檢測所需為止。

      但是,人類發明的任何體外擴增體系都是不完美的,無法做到100%精確拷貝最初的DNA樣本,每一次復制都會帶入一丁點錯誤。就像復印文稿總比原稿品質差一些一樣,經過千萬次復制再復制,就足以讓這份DNA樣本變得面目全非,干擾檢測結果。

      多次下載圖片再重新上傳也會導致圖片文件出現明顯的“劣化”。

      這一切引入的“噪音”甚至比脫靶信號本身還要高出好幾個數量級,這宛如是在汪洋大海中尋找一滴水一般。

      一舉三得該如何實現?

      找到這滴水的唯一辦法就是讓大海(各種干擾因素)消失。左二偉博士與導師楊輝還真的想到了一種絕妙的方式,同時解決了這三個問題。

      為了避免個體差異,我們又需要找到兩個基因一模一樣的細胞,為了凸顯脫靶的信號,我們又需要用到“單細胞測序”,然后我們還不能用體外擴增來復制這兩個細胞的DNA,卻又需要很大量的DNA樣本來做測序分析。

      首先最容易解決的就是找兩個基因完全一模一樣的細胞。我們知道,多數動物都是從一個受精卵發育而來的,這個受精卵一分為二,二分為四……等等,在它一分為二的時候,我們稱之為“二細胞期胚胎”階段,不就是兩個現成的基因一模一樣的細胞嗎?

      只要向其中一個注射基因編輯工具,另一個就是世界上最佳的對照。

      其次,一個細胞的DNA不是不夠檢測么?沒關系,注射完畢后我們直接把這個二細胞胚胎植入母鼠的子宮當中,讓它正常發育,這樣得到的小鼠胚胎中,理論上就有一半細胞經歷過基因編輯,另一半則沒有經歷過過。

      這時候,左二偉博士直接將發育長大的小鼠胚胎取出來,用一些特殊的酶消化成一大堆分散的細胞。利用一些方法,我們可以追蹤當時那兩個細胞的后代,從這一堆細胞中將它們倆各自的后代分成兩撥。由于這兩撥細胞也是之前的細胞分裂而來,所以它們的基因就相當于是最初那個細胞的復制品。

      這也順便解決了第三個問題,裂解掉這一大堆足以構建出半個小鼠胚胎的巨量細胞,一次性就能提取到足夠測序分析的DNA,從而避免了體外擴增帶來的噪音。

      在神經所蒲慕明所長的建議下,研究團隊將這套系統命名為GOTI。可以說,這套系統的推出,標志著人們終于得以用數字來衡量基因編輯的脫靶率。

      GOTI的技術流程:在二細胞期向一個卵裂球注射基因編輯工具,并用CRE使之本身以及后代細胞都發出紅色熒光。等小鼠胚胎發育到14.5天后取出母體,利用流式細胞儀將兩個卵裂球的后代分開,并各自全部消化掉提取DNA來做測序分析。

      哪種基因編輯易脫靶?我們挨個測一下

      終于到了檢測工具一顯身手的時候。它接下來要幫助人們回答的關鍵問題就是:那些常見的基因編輯工具真的會脫靶嗎?在GOTI的神威下,一切清晰了起來。

      首先,值得慶幸的是,最經典的spCas9系統經受住了考驗。結果顯示,它引起異常基因突變的可能性不高于小鼠自身細胞分裂帶來的本底基因突變。就是說,從目前的檢測結果來看它是安全的。

      CRISPR-Cas9系統已經成為目前最方便的基因編輯工具。圖片來源:origene.com

      與此同時最令人大跌眼鏡的發現是,另一類叫做單堿基突變系統(Base Editor)的基因編輯工具有著異常高的脫靶率。所謂的單堿基突變系統,大致上可以理解為我們先設計一個只能精確靶向但不會切割DNA的Cas9蛋白,然后讓這個Cas9蛋白牽著一個能夠通過化學方法將某個堿基定向突變(比如A→T)的酶來給DNA鏈中引入點突變。

      原本這套系統因為不會引入DNA斷裂,被視為特別安全的一類基因編輯技術,人們從來不覺得它會脫靶,之前的脫靶檢測也完全沒有發現它有任何脫靶的跡象。因此以劉如謙(David Liu)等為代表的一群科學家長期都在致力于將這項技術作為基因編輯向臨床進軍的急先鋒。

      通過檢測發現,經典的CRISPR/Cas9并沒有顯著的脫靶現象,但是單堿基編輯系統BE3則出現了高出背景基因突變水平數倍的脫靶現象。

      這時候研究團隊才突然意識到,就算Cas9沒有在sgRNA帶領下跟任何DNA序列結合,那個能夠引起堿基定向改變的酶也依舊存在,它完全可以像任何在細胞里游離的酶一樣,讓任何偶然接觸自己的堿基發生化學反應。這樣的系統天然就有高脫靶率的,可能之前大家對“沒有DNA鏈斷裂就沒有脫靶”形成了思維定勢,才會忽視這一安全漏洞。

      長久以來,因為缺少令所有人都信服的脫靶檢測技術,基因編輯的脫靶問題被吵吵嚷嚷了五年多,也讓這個領域在此期間一直處于野蠻生長的狀態。

      圖片來源:圖蟲創意

      如今,GOTI出現了,規則還會遠嗎?(編輯:Yuki)

      參考文獻:

      1. Zuo, E.#, Sun, Y.#, Wu, W.#, Yuan, T.#, Ying, W., Sun, H., Yuan, L., Steinmetz, L., Li, Y.*, Yang, H.*(2019)Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos. Science Online
      2. Schaefer, K. A., Wu, W. H., Colgan, D. F., Tsang, S. H., Bassuk, A. G., & Mahajan, V. B. (2017). Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nature methods, 14(6), 547-548.

      作者名片

      熱門評論

      • 2019-03-02 11:15 Karlson

        這就叫“識破不值半文錢”,他們成功的實現了之后,再把原理講出來,即使我們這種非這個領域的人,也都會一拍大腿,這tm多簡單啊。業內的人,恐怕還得加上一句:我tm當初也這么想過啊。

        [6] 評論
      • 2019-03-01 16:30 天降龍蝦

        這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        [6] 評論
      • 2019-03-01 21:17 毛騾 金屬材料學博士
        引用@天降龍蝦 的話:這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        不,是就怕萬一出問題怎么辦。

        [3] 評論

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      全部評論(21)
      • 1樓
        2019-03-01 16:30 天降龍蝦

        這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        [6] 評論
      • 2樓
        2019-03-01 21:17 毛騾 金屬材料學博士
        引用@天降龍蝦 的話:這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        不,是就怕萬一出問題怎么辦。

        [3] 評論
      • 3樓
        2019-03-02 11:15 Karlson

        這就叫“識破不值半文錢”,他們成功的實現了之后,再把原理講出來,即使我們這種非這個領域的人,也都會一拍大腿,這tm多簡單啊。業內的人,恐怕還得加上一句:我tm當初也這么想過啊。

        [6] 評論
      • 4樓
        2019-03-02 17:48 超級無敵小仙女

        [0] 評論
      • 5樓
        2019-03-03 14:59 漢尼拔wang
        引用文章內容:結果顯示,它引起異常基因突變的可能性不高于小鼠自身細胞分裂帶來的本底基因突變。就是說,從目前的檢測結果來看它是安全的。

        X man 呼之欲出~

        [1] 評論
      • 6樓
        2019-03-03 22:17 54434
        引用@天降龍蝦 的話:這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        可以進行檢測,但是那些按反轉商人的邏輯,那個嬰兒本身就是個大腫瘤,活不長,所以你說什么都不管事:我不聽我不聽我不聽!

        [0] 評論
      • 7樓
        2019-03-03 22:22 神秘進化記錄

        又邁出了里程碑的一步,可喜可賀~

        [0] 評論
      • 8樓
        2019-03-05 10:15 q68257962

        沒看出來新方法如何規避自身細胞分裂帶來的突變,也沒看出舊方法為什么不能得出“它引起異常基因突變的可能性不高于小鼠自身細胞分裂帶來的本底基因突變”的結論。

        [0] 評論
      • 9樓
        2019-03-05 10:53 CBP
        引用@54434 的話:可以進行檢測,但是那些按反轉商人的邏輯,那個嬰兒本身就是個大腫瘤,活不長,所以你說什么都不管事:我不聽我不聽我不聽!

        如今可以檢測對人類當試驗體的情況來說沒有意義啊,那兩個小孩據說已經出生了.而為什么很多人支持轉基因作物而不支持人類的基因編輯的原因就在于,轉基因作物育種脫靶了,沒關系,直接刪選掉,失敗品進垃圾堆就是了,安全無害也沒有人會說你殘忍殺害農作物對吧,可是人類怎么辦?把那兩個小孩掐死?還是說一輩子軟禁以防止他們污染人類基因庫?

        [1] 評論
      • 10樓
        2019-03-06 21:14 54434
        引用@CBP 的話:如今可以檢測對人類當試驗體的情況來說沒有意義啊,那兩個小孩據說已經出生了.而為什么很多人支持轉基因作物而不支持人類的基因編輯的原因就在于,轉基因作物育種脫靶了,沒關系,直接刪選掉,失敗品進垃圾堆就是了...

        文中所講的應該是在合適的培養條件下,在胚胎發育初期就可以進行檢測,墮胎在大部分情況下除天主教之外并不涉及任何問題,所以在未來應該是很有前景的,只不過由于現在人們價值觀及道德觀不允許所以暫時沒有條件應用。可體外子宮還并不成熟,還是再等個幾十年吧

        [0] 評論
      • 11樓
        2019-03-06 21:15 54434
        引用@CBP 的話:如今可以檢測對人類當試驗體的情況來說沒有意義啊,那兩個小孩據說已經出生了.而為什么很多人支持轉基因作物而不支持人類的基因編輯的原因就在于,轉基因作物育種脫靶了,沒關系,直接刪選掉,失敗品進垃圾堆就是了...

        乍一看以為饅頭老妖呢,你頭像太有迷惑性了

        [0] 評論
      • 12樓
        2019-03-07 13:18 章魚丸子II世
        引用@天降龍蝦 的話:這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        不是健康的問題,是該不該做,起碼是,現在該不該做的問題。這涉及倫理道德問題,基因編輯嬰兒可以去掉某些疾病,哪么有一天,某人說把我后代的基因編輯下,讓我的后代成為超級健康超級聰明的人,那該怎么辦?如果某政府說,搞一批基因編輯嬰兒,讓他們成為超級戰士,怎么辦?這些事兒,現在人類還沒想清楚該如何應對。

        [0] 評論
      • 13樓
        2019-03-07 14:44 天降龍蝦
        引用@章魚丸子II世 的話:不是健康的問題,是該不該做,起碼是,現在該不該做的問題。這涉及倫理道德問題,基因編輯嬰兒可以去掉某些疾病,哪么有一天,某人說把我后代的基因編輯下,讓我的后代成為超級健康超級聰明的人,那該怎么辦?如果某...

        俺知道。。。俺現在只是關心那倆已經被轉了基因的孩子是否能有比較大的概率是健康的,至于別的倫理規范和管理的問題,可以以后再說吧。。。。

        [0] 評論
      • 14樓
        2019-03-13 11:34 霜焰
        引用@毛騾 的話:不,是就怕萬一出問題怎么辦。

        萬一變成驚奇隊長怎么辦?

        [0] 評論
      • 15樓
        2019-03-13 11:36 霜焰
        引用@天降龍蝦 的話:俺知道。。。俺現在只是關心那倆已經被轉了基因的孩子是否能有比較大的概率是健康的,至于別的倫理規范和管理的問題,可以以后再說吧。。。。

        極大概率是普通路人甲,有什么隱患的概率和天生武功蓋世天下無敵的概率是一樣的。

        [0] 評論
      • 16樓
        2019-03-13 12:11 毛騾 金屬材料學博士
        引用@霜焰 的話:萬一變成驚奇隊長怎么辦?

        變成臭臭泥的幾率都比變驚奇隊長高

        [0] 評論
      • 17樓
        2019-03-15 22:18 霜焰
        引用@毛騾 的話:變成臭臭泥的幾率都比變驚奇隊長高


        無論是變成驚奇隊長還是臭臭泥,都不是目前的基因能做到的,幾率都是0%,0%=0%,怎么會高?

        [0] 評論
      • 18樓
        2019-03-17 14:43 你這是自尋箱子
        引用@天降龍蝦 的話:這是否是說,賀建奎搞出來的基因編輯嬰兒,她們的健康其實還是可以得到保證的???

        理論上是。

        然而本位面的地球人類的技術和理論往往不能統一。

        [0] 評論
      • 19樓
        2019-03-17 19:26 這個昵稱沒有被人使用
        引用文章內容:勝卷在握的他

        文章發出來作者自己看過嗎?……

        [0] 評論
      • 20樓
        2019-03-18 09:50 毛騾 金屬材料學博士
        引用@霜焰 的話: 無論是變成驚奇隊長還是臭臭泥,都不是目前的基因能做到的,幾率都是0%,0%=0%,怎么會高?

        這里要求極限!

        [0] 評論
      • 21樓
        2019-03-18 11:18 天降龍蝦
        引用@你這是自尋箱子 的話:理論上是。然而本位面的地球人類的技術和理論往往不能統一。

        所以我們有時需要一點小迷信?????

        [0] 評論

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